Synergie zwischen den antimikrobiellen Peptiden der Winterflunder

Nov 25, 2023

npj Antimicrobials and Resistance Band 1, Artikelnummer: 8 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Einige antimikrobielle Peptide (AMPs) haben eine starke bakterizide Wirkung und werden als potenzielle Alternativen zu klassischen Antibiotika in Betracht gezogen. Als Reaktion auf eine Infektion werden solche AMPs bei Tieren häufig zusammen mit anderen Peptiden mit geringer oder keiner wahrnehmbaren antimikrobiellen Aktivität produziert, deren Rolle unklar ist. Hier zeigen wir, dass sechs AMPs aus der Winterflunder (WF) synergetisch gegen eine Reihe bakterieller Krankheitserreger wirken und liefern mechanistische Einblicke, wie dies die Kooperativität der dosisabhängigen bakteriziden Aktivität und Wirksamkeit erhöht, die eine Therapie ermöglichen. Nur zwei WF-AMPs weisen bei alleiniger Verwendung eine starke antimikrobielle Aktivität auf, wir finden jedoch, dass eine Reihe von Zwei-Wege-Kombinationen, an denen Peptide beteiligt sind, die ansonsten eine geringe oder keine Aktivität aufweisen, eine starke antimikrobielle Aktivität ergeben. Schwach aktive WF-AMPs modulieren die Membraninteraktionen der wirksameren WF-AMPs und ermöglichen die Therapie in einem Modell einer Verbrennungswundeninfektion durch Acinetobacter baumannii. Die beobachtete Synergie und das entstehende Verhalten erklären möglicherweise die evolutionären Vorteile der Produktion einer Familie verwandter Peptide und sind attraktive Eigenschaften, die bei der Entwicklung von AMPs für klinische Anwendungen berücksichtigt werden sollten.

Im deutlichen Gegensatz zur Entstehung und Ausbreitung von Resistenzen gegen Antibiotika nach den 1930er Jahren sind antimikrobielle Peptide (AMPs) im Laufe der Evolutionsgeschichte ein wirksamer Bestandteil des angeborenen Immunsystems geblieben. Die Hauptunterschiede zwischen den meisten Antibiotika im klinischen Einsatz und AMPs bestehen darin, dass letztere schnell bakterizid wirken und ihre dosisabhängige bakterizide Aktivität sehr kooperativ ist1,2. Diese wünschenswerte pharmakodynamische (PD) Eigenschaft sollte sicherstellen, dass ein kleineres „Mutantenselektionsfenster“ existiert, wodurch der mit einer versuchten therapeutischen Reaktion verbundene Selektionsdruck minimiert wird. Wenn bei Bakterien experimentell eine Resistenz gegen AMPs entwickelt wird, üblicherweise unter Bedingungen einer subminimalen Hemmkonzentration (MIC), kann eine verringerte Empfindlichkeit erreicht werden und es besteht auch das Risiko einer Kreuzresistenz zwischen exogenen AMPs und menschlichen Abwehrpeptiden3. Allerdings ist eine solche Anpassung relativ bescheiden und kann durch evolutionäre Zwänge eingeschränkt sein4,5. Wenn ihre verbesserten PD-Eigenschaften tatsächlich das Risiko einer Resistenzbildung gegen AMPs mindern, würde ihre schnelle Produktion und/oder Abgabe bei Konzentrationen oberhalb der MIC-Konzentration sicherstellen, dass ihr Nutzen anhält.

Analog zum Einsatz von Kombinationstherapien in der Klinik zur Reduzierung der Resistenzraten6 wurde festgestellt, dass Kombinationen unterschiedlicher AMPs in vitro verbesserte PD-Eigenschaften aufweisen2. Die ausgewählten AMPs stammten jedoch aus unterschiedlichen Organismen und ungeachtet unserer eigenen Arbeit mit Temporin L und Temporin B aus Rana temporaria ist noch nicht klar, inwieweit AMPs aus demselben Organismus kombiniert werden können, um sowohl die antibakterielle Wirksamkeit als auch die Kooperativität zu verbessern die bakterizide Aktivität7.

Die Winterflunder (WF), Pleuronectes americanus, produziert das AMP Pleurocidin8, dessen starke antimikrobielle Breitbandaktivität auf ihre doppelte Fähigkeit zurückzuführen ist, sowohl die bakterielle Plasmamembran zu schädigen9,10 als auch sie zu durchdringen, um Zugang zu intrazellulären Zielen zu erhalten11,12 ,13. Das Gleichgewicht des Beitrags der beiden Effekte zur bakteriziden Wirkung kann je nach Bakterienart unterschiedlich sein und kann durch die Ernährungsumgebung und damit den Bakterienstoffwechsel beeinflusst werden14. Pleurocidin-Analoga mit verstärkter membranzerstörender Aktivität sind möglicherweise robuster und ausreichend wirksam, um wirksame Therapeutika zu sein, selbst wenn sie systemisch in anspruchsvollen Modellen bakterieller Lungeninfektionen verabreicht werden14. Da eine vom Wellcome Trust in Auftrag gegebene Überprüfung des Pipeline-Portfolios15 „eine starke Unterstützung der Finanzierung bei gleichzeitiger Überwachung bahnbrechender Erkenntnisse zur systemischen Therapie“ für eine Reihe von Ansätzen, die AMPs umfassen, empfiehlt, ist das Potenzial für die Weiterentwicklung von Pleurocidin und seinen Analoga klar.

Nach der Identifizierung von Pleurocidin wurden weitere WF-AMPs entdeckt16,17. Antibakterielle Empfindlichkeitstests von Pleurocidin (als WF2 bezeichnet) und fünf weiteren WF-AMPs (Sequenzen in Tabelle 1 angegeben) ergaben, dass WF1a-1 das breite Wirkungsspektrum von WF2 teilte, während WF4 nur gegen gramnegative Bakterien aktiv war17. Die antibakteriellen Aktivitäten von WF1, WF1a und WF3 waren mäßig oder fehlten17. Es ist noch nicht bekannt, ob zwischen den aktiven oder scheinbar inaktiven WF-AMPs Synergien in Bezug auf die Wirksamkeit oder andere Parameter bestehen und ob daher die Leistung von Pleurocidin verbessert werden kann oder ob andere Kombinationen sein Potenzial als Therapeutikum übertreffen könnten. Schachbrett-Assays werden häufig verwendet, um synergistische Wirksamkeitsgewinne für Zwei-Wege-Kombinationen zu ermitteln, wobei eine Wachstumshemmung mit weniger als der Hälfte der Menge jeder Komponente, die für die Hemmung bei alleiniger Verwendung erforderlich ist, üblicherweise als definierende Synergie angesehen wird18. Eine solche Methodik ist umständlich und ineffizient, wenn sie auf Synergien in drei Richtungen oder höherer Ordnung angewendet wird, und es wurde eine elegante Methode vorgeschlagen, bei der die Menge eines bestimmten Antibiotikums bestimmt wird, die erforderlich ist, um einen kleinen (1 %, 5 % oder 15 %) Hemmungseffekt auf das Wachstum zu erzielen . Wenn diese Konzentrationen in Zweierkombinationen oder Kombinationen höherer Ordnung gemischt werden, gibt es Raum für eine Hemmung, die über die erwartete Hemmung durch additive Beiträge hinausgeht, die für bis zu mindestens Fünferkombinationen identifiziert werden kann19. Unseres Wissens wurde diese Methode noch nicht auf AMPs angewendet.

Daher bewerten wir in der vorliegenden Studie, ob Synergien in Zwei-Wege-Kombinationen bestehen, und bewerten die Methode von Tekin et al. zur Identifizierung synergistischer Kombinationen höherer Ordnung von WF-AMPs. Wir testen, ob Synergie die In-vitro-Pharmakodynamik beeinflusst, die ihre bakterizide Aktivität beschreibt, und bestimmen ihre Auswirkung auf die Ergebnisse in einem Galleria mellonella-Verbrennungswunden-Acinetobacter-baumannii-Infektionsmodell. Nachdem wir festgestellt haben, dass Synergien zwischen WF-AMPs sowohl für die In-vitro-PD- als auch für die In-vivo-Therapie weit verbreitet und vorteilhaft sind, verwenden wir eine Kombination aus Steady-State- und zeitaufgelösten biophysikalischen Methoden, um mechanistische Einblicke zu gewinnen. Insbesondere betrachten wir, wie die Membraninteraktion ausgewählter WF-AMPs durch die Anwesenheit synergistischer Partner ohne die Bildung von Heterooligomeren beeinflusst wird und wie solche Interaktionen sowohl die Steigerung der Wirksamkeit als auch eine höhere Kooperativität bei der bakteriziden Wirkung unterstützen könnten.

Wir haben zunächst das Spektrum der antimikrobiellen Aktivität der sechs WF-AMPs anhand einer Reihe gut charakterisierter Bakterienisolate bewertet, deren Empfindlichkeit gegenüber anderen AMPs und membranaktiven antimikrobiellen Mitteln bekannt ist (Tabelle 2)7,14,20,21,22. Aufgrund des marinen Ursprungs der WF-Peptide haben wir auch zwei repräsentative Vibrio-Isolate einbezogen, V. parahaemolyticus und V. vulnificus. In Übereinstimmung mit der früheren Arbeit von Patrzykat et al.17 stellen wir fest, dass sowohl WF2 (Pleurocidin) als auch WF1a-1 hochwirksame antimikrobielle Mittel sind, wobei WF2 das breiteste Aktivitätsspektrum und WF1a-1 die beste gramnegative Aktivität aufweist (MICs 0,25). –8 µg/ml), insbesondere für P. aeruginosa, (Tabelle 2). Um dies weiter zu untersuchen, haben wir D-Analoga hergestellt, um den proteolytischen Abbau abzuschwächen, und ihre Aktivität separat gegen eine erweiterte Gruppe von P. aeruginosa-Isolaten getestet (Ergänzungstabelle 1). Die Leistung von D-WF1a-1 ist weitgehend mit der von D-Pleurocidin vergleichbar, wenn nicht sogar etwas besser. Im Gegensatz zu WF2, mit dem es weitgehende Sequenzidentität aufweist (Tabelle 1), ist die antibakterielle Aktivität von WF4 auf gramnegative Bakterien beschränkt und es ist auch weniger aktiv gegen Klebsiella pneumoniae und, wie zuvor17, unwirksam gegen P. aeruginosa. WF4 hat jedoch eine bemerkenswerte Wirksamkeit gegen A. baumannii und Vibrio spp. was bisher unbeschrieben ist. Wiederum im Einklang mit früheren Arbeiten17 stellen wir fest, dass WF1, WF1a und WF3 größtenteils inaktiv sind, aber beide A. baumannii-Stämme anfällig für WF1 sind, was erneut die allgemeine Anfälligkeit dieser Art für AMPs14,20,21 unterstreicht.

Wir haben drei Ansätze verwendet, um Synergien zwischen WF-AMPs zu untersuchen. Zunächst verwendeten wir die Methode von Tekin et al.19, um die Prävalenz von Zwei-Wege-Synergien und Synergien höherer Ordnung für die WF-AMPs gegen K. pneumoniae NCTC 13368 als Netto-Bliss-Synergie oder entstehende Synergie zu untersuchen (Tabelle 3 und Ergänzungstabellen 2 und 3). ). Mit dieser Methodik führten Zwei-Wege-Kombinationen von WF1a/WF1a-1 (p = 0,002), WF1a/WF2, WF1a-1/WF3 und WF2/WF3 (alle p < 0,0001) zu einer deutlich stärkeren Wachstumshemmung als von einem Zusatzstoff vorhergesagt Kombination jedes Peptids und gelten daher als neu auftretend. Bei Bedingungen höherer Ordnung hängt die Identifizierung auftretender Effekte, bei denen die Synergie das Ergebnis der gesamten Kombination und nicht eines einzelnen Paars innerhalb der Kombination ist, von der Identifizierung einer Wachstumshemmung ab, die über die hinausgeht, die mit den entsprechenden synergistischen Kombinationen niedrigerer Ordnung erreicht wird erwarteter additiver Effekt. Allerdings wird die Fähigkeit, solche auftauchenden Effekte zu identifizieren, im derzeit konfigurierten Assay durch die erhebliche Wachstumshemmung behindert, die bei Zwei-Wege-Kombinationen beobachtet wird, in denen jeweils fünf der sechs WF-AMPs vertreten sind (Tabelle 3). Dies gilt selbst dann, wenn die einzelnen Komponenten bei alleiniger Verwendung keine nachweisbare Hemmung hervorriefen, und spiegelt wahrscheinlich die äußerst kooperative und schnell bakterizide Natur aller WF-AMPs wider. Durch ein weniger strenges Maß an Synergie erzeugen dreizehn von zwanzig Drei-Wege-Kombinationen (Tabelle 3), zwölf von fünfzehn Vier-Wege-Kombinationen und alle Sechs-Wege- und Fünf-Wege-Kombinationen eine deutlich größere als additive Hemmwirkung (Ergänzungstabellen 3 und 4).

Anschließend versuchten wir, mögliche synergistische Binärkombinationen für drei verschiedene Bakterienarten zu identifizieren, indem wir antibiotikaresistente Isolate (EMRSA-15 NCTC 13616, K. pneumoniae NCTC 13368 und A. baumannii AYE) auswählten und gleichzeitig den oben verwendeten Ansatz validierten. Wir verwendeten eine Screening-Methode, bei der zwei WF-AMPs in einem ihren MHK-Werten entsprechenden Verhältnis gemischt und wie in einem Standard-Bouillon-Mikroverdünnungstest seriell verdünnt wurden (Tabelle 4). Die beiden Methoden stimmen im Allgemeinen überein, wobei das Screening auch eine Synergie zwischen WF1a/WF1a-1, WF1a/WF2 und WF2/WF3 gegen K. pneumoniae NCTC 13368 identifiziert. Das Screening schlägt zusätzlich eine weitere Kombination (WF3/WF4) mit der Diskrepanz vor Dies ist auf die leicht unterschiedlichen Methoden und unterschiedlichen Stöchiometrien zurückzuführen, die in den beiden Ansätzen verwendet werden. Beim Screening der drei Isolate wurde für neun von fünfzehn möglichen Zwei-Wege-WF-AMP-Kombinationen eine starke Synergie (FIC < 0,50) gefunden, die jedoch vom getesteten Bakterienisolat abhängt. Nur zwei Kombinationen erzeugen Synergien gegen alle drei Isolate – die Kombinationen von WF1a mit entweder WF2 oder WF1a-1 –, während andere Kombinationen Synergien gegen zwei oder nur eines der Isolate erzeugen. Die Kombinationen von WF2/WF3 und WF3/WF4 erzeugen beide Synergien gegen beide gramnegativen Isolate. Bemerkenswert ist, dass alle sechs WF-AMPs an mindestens einer synergistischen Kombination beteiligt sind und in jeder der gefundenen synergistischen Zwei-Wege-Kombinationen mindestens einer der Partner bei alleiniger Verwendung eine begrenzte oder keine Aktivität aufweist.

Schließlich haben wir in früheren Arbeiten herausgefunden, dass ein Analogon von Pleurocidin, bei dem Lysinreste durch Argininreste ersetzt wurden und aus D-Aminosäuren bestanden, sowohl robust gegenüber serumhaltigen Kulturmedien von Säugetierzellen als auch wirksam bei einer in vivo EMRSA-15 NCTC 13616-Lungeninfektion war Modell 14 verwendeten wir Schachbrett-Assays, um zu sehen, ob das D-Enantiomer von WF1a (D-WF1a) in Synergie mit D-Pleurocidin und/oder seinem Analogon D-Pleurocidin-KR wirkt (Ergänzungstabelle 4). Beim Test gegen EMRSA-15 NCTC 13616 oder P. aeruginosa RP73 in RPMI (mit 5 % FBS) wird mit beiden Kombinationen eine starke Synergie (FIC < 0,5) erreicht. In den analogen Experimenten mit MHB wird die Synergie jedoch geschwächt oder geht verloren, und die Daten stimmen mit geringfügigen Änderungen im Wirkmechanismus oder der Fähigkeit zur Interaktion mit Zielen überein, die sich auf die Synergie auswirken.

Oben betrachten wir Synergien lediglich im Hinblick auf eine Steigerung der antibakteriellen Wirksamkeit, andere Änderungen im WF-AMP-Verhalten können jedoch aufgrund von Synergien auftreten. In Arbeiten anderer wurde für Zwei-Wege- und Drei-Wege-Kombinationen verschiedener AMPs aus verschiedenen Organismen festgestellt, dass Kappa, ein Parameter, der die Kooperativität der dosisabhängigen bakteriziden Abtötungsrate beschreibt, die in vitro bestimmt wurde, im Durchschnitt für Drei-Wege-Kombinationen ansteigt Kombinationen1. In unserer eigenen Arbeit, die wiederum in vitro durchgeführt wurde, stellten wir fest, dass die Kooperativität der bakteriziden Aktivität von Temporin L gegen EMRSA-15 NCTC 13616 in Gegenwart eines anderen AMP, Temporin B, das von demselben Frosch produziert wurde, geringfügig, aber signifikant zunahm7. Der Wirksamkeitsgewinn, der durch die synergistische Kombination der Temporine erzielt wird, ist jedoch gering und die Kooperativität ist geringer als die, die durch Pleurocidin (WF2) allein unter den gleichen Bedingungen erreicht wird7.

In der vorliegenden Studie haben wir daher getestet, ob das In-vitro-PD-Profil von WF2 durch seine viel weniger wirksamen, synergistischen Partner WF1a oder WF3 beeinflusst wird, und haben dies mit der Wirkung einer anderen WF-AMP-Kombination, WF3/WF4, sowie relevanter bakterizider Antibiotika verglichen gegen drei verschiedene Bakterienisolate unter zwei verschiedenen Bedingungen (Abb. 1). Alle WF-AMPs und alle WF-AMP-Kombinationen erzeugen eine wesentlich schnellere bakterizide Aktivität als alle getesteten klinisch verwendeten Antibiotika, wobei AMPs in Minuten und die Antibiotika in Stunden abtöten (ergänzende Abbildung 1), und dies spiegelt sich in den Nettowachstumsraten der Bakterien wider ( Abb. 1a, c, e). Die maximale Abtötungsrate wird bei oder innerhalb des Zweifachen der MHK für ATCC 17978 (Abb. 1a) und ca. erreicht. zehnmal so hoch wie die MHK für AYE (Abb. 1c) und EMRSA-15 NCTC 13616 (Abb. 1e). Mit Ausnahme von Gentamicin für A. baumanii 17978, das mit allen AMPs und AMP-Kombinationen vergleichbar ist, und Daptomycin in EMRSA-15 NCTC 13616, das WF2 nicht unterlegen ist (jedoch D-WF2 und der Kombination von D-WF2 überlegen ist). /D-WF1a) gilt dieser Vergleich auch für die Kooperativität der dosisabhängigen Aktivität, die im Allgemeinen für die WF-AMPs viel größer ist als das, was für die klinisch verwendeten Antibiotika beobachtet wird (Abb. 1b, d, f).

In-vitro-Pharmakodynamiktests für ausgewählte WF-Peptide und Kombinationen davon sowie bakterizide, klinisch relevante Antibiotika, für die jeder Stamm anfällig bleibt: A. baumannii ATCC 17978 in MHB (a, b), A. baumanii AYE in MHB (c, d) oder EMRSA-15 NCTC 13616 in RPMI mit 5 % FBS (e, f) wurden steigenden Konzentrationen von WF AMPs, WF AMP-Kombinationen oder klinisch relevanten Antibiotika ausgesetzt. Die gezeigten Kurven sind Anpassungen der Mittelwerte von drei unabhängigen wiederholten Experimenten (a, c, e) und zeigen die Änderung der bakteriziden Rate als Funktion der Dosis, angegeben als Bruchteile oder Vielfache der MHK (× MHK). Einfaktorielle ANOVA mit Tukey-Post-hoc-Test-Mehrfachvergleichen für Kappa (b, d, f) verdeutlichen die Unterschiede in der Kooperativität zwischen den WF-AMPs, Kombinationen davon und Antibiotika. Dargestellt sind Mittelwert und SE von drei unabhängigen wiederholten Experimenten. Es werden nur signifikante paarweise Vergleiche zwischen AMPs oder zwischen klinisch verwendeten Antibiotika gezeigt (Vergleiche zwischen AMPs und Antibiotika finden Sie im Haupttext): *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. Ausgewählte Zeitkillkurven, die zur Konstruktion der PD-Kurven in a verwendet werden, sind im Zusatzmaterial enthalten (Ergänzende Abbildung 1).

Da WF1a und WF3 eine relativ schwache antibakterielle Wirkung haben, haben wir für diese Peptide allein keine In-vitro-PD-Experimente durchgeführt. Daher ist es fraglich, ob die Kooperativität der bakteriziden Aktivität für die Kombinationen lediglich die des weniger wirksamen Partners widerspiegelt oder eine emergente Eigenschaft der Kombination ist. Dennoch führt in jedem der drei separaten Experimente die Anwesenheit von WF1a oder seinem D-Enantiomer neben Pleurocidin/WF2 oder seinem D-Enantiomer zu einer Erhöhung der Kooperativität der starken und nützlichen bakteriziden Aktivität (Abb. 1b, d, f). ). Das Vorhandensein von WF3 hat einen ähnlichen Effekt auf die Kooperativität gegenüber A. baumannii AYE (Abb. 1d), wenn es entweder mit WF2 oder WF4 vorhanden ist, dies wird jedoch bei ATCC 17978 nicht beobachtet (Abb. 1b). Weitere Beobachtungen umfassen: (1) Während die maximale bakterizide Abtötungsrate unbeeinflusst bleibt, ist die für die WF-AMPs und Kombinationen beobachtete Kooperativität im Allgemeinen für das antibiotikaresistentere A. baumannii AYE (Abb. 1c, d) im Vergleich zu dem antibiotikastärkeren AYE geringer anfälliges ATCC 17978 (Abb. 1a, b) und; (2) Die bakterizide Wirkung des D-Enantiomers von Pleurocidin/WF2 gegen EMRSA-15 NCTC 13616 (in RPMI mit 5 % FBS) ist im Vergleich zur Wirkung des L-Enantiomers stärker kooperativ (Abb. 1e, f). .

Nachdem wir bei der Kombination von WF-AMPs sowohl eine Steigerung der Wirksamkeit als auch der Kooperativität festgestellt hatten, wollten wir herausfinden, ob dies zu einer Steigerung der therapeutischen Wirksamkeit bei einer Verbrennungswundeninfektion bei Wirbellosen führt (Abb. 2 und Tabelle 5). Larven der Großen Wachsmotte, Galleria mellonella, wurden kürzlich verwendet, um ein Modell für Verbrennungswundeninfektionen bei Wirbellosen zu etablieren23. Anhand dieses Modells haben wir eine Therapie mit synergistischen Kombinationen von Gentamicin und Bolalipiden demonstriert und festgestellt, dass Gentamicin (5 mg/kg), das weltweit zur Behandlung infizierter Brandwunden eingesetzt wird, als Monotherapie schützend wirkt22. Hier schneidet Gentamicin im Vergleich zu den anderen drei Antibiotika-Interventionen gut ab (Abb. 2a und Tabelle 5), und die Reihenfolge des Therapieerfolgs (Gentamicin > Ciprofloxacin > Imipenem > Meropenem) entspricht der Reihenfolge der maximalen bakteriziden Abtötungsrate (Abb. 1a).

Überlebenskurven werden für dreißig Larven aufgezeichnet, die jeweils mit klassischen Antibiotika (a), WF2 (Pleurocidin) (b), Kombinationen aus WF2 und entweder WF3 oder WF1a (c) oder WF3 und/oder WF4 (d) behandelt wurden im Vergleich zu fünfzig Larven, die über 96 Stunden nur einer Verbrennung oder einer Verbrennung plus Infektion (A. baumannii ATCC 17978) ausgesetzt waren. Das prozentuale Überleben sowie Signifikanztests zum Schutz vor Infektionen aufgrund der Therapie gemäß Log-Rank-Test (Mantel-Cox) oder Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test sind in Tabelle 5 aufgeführt.

Eine mittlere Dosis von 10 mg/kg WF2 (Pleurocidin) bietet einen ähnlichen Schutz wie 5 mg/kg Gentamicin, niedrigere (2,5 mg/kg) oder höhere (20 mg/kg) Dosen von Pleurocidin bieten jedoch keinen signifikanten Schutz (Abb . 2b und Tabelle 5). Im Gegensatz dazu werden mit niedrigen Dosen (2,5 mg/kg) von WF2 in Kombination mit WF1a (50 mg/kg) oder WF3 (20 mg/kg) ähnliche Schutzniveaus wie durch Gentamicin erreicht, wobei diese beiden AMPs keinen bieten Schutz bei alleiniger Verwendung (Abb. 2c und Tabelle 5). Interessanterweise bietet eine Kombination von 20 mg/kg WF3 und 5 mg/kg WF4 vollständigen Schutz, während die Verwendung eines dieser AMPs allein keinen bietet (Abb. 2d und Tabelle 5).

Nachdem festgestellt wurde, dass die Synergie zwischen WF-AMPs zu einer Steigerung der Wirksamkeit, einem verbesserten pharmakodynamischen Profil und therapeutischen Ergebnissen führt, fragten wir, ob wir Erkenntnisse auf molekularer Ebene darüber gewinnen könnten, wie dies beeinflusst werden könnte. Es ist bemerkenswert, dass WF2 und WF4 und getrennt WF1 und WF1a wesentliche Sequenzidentitäten und Ähnlichkeiten aufweisen (Tabelle 1) und sich dennoch offensichtlich in ihren antibakteriellen Eigenschaften und ihrer Fähigkeit, an synergistischen Kombinationen teilzunehmen, unterscheiden. Da ein einzelnes AMP nicht in der Lage ist, selbst eine Pore in der Lipidmembran zu bilden, halten einige die Bildung von AMP-Aggregaten für wesentlich für ihre Aktivität24, und der Synergismus für andere AMPs wurde zumindest teilweise durch die Bildung von Heterooligomeren erklärt7, 25,26,27,28,29. Wir haben daher eine biophysikalische Untersuchung der Konformation und Struktur von WF-AMP sowie ihrer Wechselwirkungen mit Modellen bakterieller Plasmamembranen durchgeführt, um Unterschiede in ihrem Verhalten zu charakterisieren und besser zu verstehen und Aspekte zu identifizieren, die zum Synergismus beitragen könnten.

Die WF-Peptide haben alle das Potenzial, Konformationen mit sekundärer Amphipathie anzunehmen und sind von ähnlicher Länge (Tabelle 1). Von den sechs Peptiden ist WF3 deutlich hydrophober als die anderen fünf Peptide, insbesondere am N-Terminus. WF2, WF3 und WF4 werden bei saurem pH-Wert alle hydrophiler, während WF1, WF1a und WF1a-1 umgekehrt hydrophober werden. Alle sechs Peptide werden bei niedrigerem pH-Wert kationischer. Alle sechs Peptide sind bemerkenswert reich, nicht nur an basischen und hydrophoben Resten, wie es bei kationischen amphipathischen AMPs üblich ist, sondern auch an Glycin, einer Aminosäure, die bekanntermaßen Konformationsflexibilität verleiht.

Zuvor haben wir gezeigt, dass Pleurocidin zwar amphipathische α-Helix-Konformationen annimmt, jedoch weniger geordnet ist und/oder sich in Modellen, die die geordnete Plasmamembran genauer widerspiegeln, durch eine erhebliche Konformationsflexibilität auszeichnet13,14,30. Hier präsentieren wir vier Beweise dafür, dass Pleurocidin und die anderen WF-Peptide jeweils sowohl α-Helix- als auch PII-Konformationen (Polyprolin-II) annehmen können.

Zunächst verwendeten wir Zirkulardichroismus (CD) im fernen UV, um die Konformation aller sechs WF-AMPs in wässriger Lösung als Funktion der Temperatur zu untersuchen (ergänzende Abbildung 2). Die bei niedrigeren Temperaturen erhaltenen Spektren sind oberflächlich betrachtet charakteristisch für eine ungeordnete Konformation, aber beim Erhitzen kommt es zu einer erheblichen Veränderung in den Spektren aller sechs AMPs, was darauf hindeutet, dass bei niedrigeren Temperaturen Beiträge zu den CD-Spektren von einer geordneten oder halbgeordneten Sekundärstruktur stammen . Bemerkenswert ist, dass die Intensität der negativen Bande bei 197 nm um fast die Hälfte abnimmt, während eine markante Erhebung bei etwa 220 nm ebenfalls verringert wird. Diese Merkmale sind charakteristisch für die PII-Konformation, auch wenn sie in Modellpeptiden stärker ausgeprägt sind31. Die bei niedrigeren Temperaturen erhaltenen Spektren sind daher charakteristisch für eine Mischung aus fehlgeordneten und PII-Konformationen, wobei letztere beim Erhitzen reduziert werden.

Zweitens verwendeten wir Fern-UV-CD, um die Konformation der WF-AMPs in drei Modellen bakterieller Plasmamembranen zu untersuchen (Abb. 3a – c). In anionischen Natriumdodecylsulfat (SDS)-Mizellen weisen die CD-Spektren aller sechs WF-AMPs die Merkmale geordneter α-Helix-Konformationen mit einer markanten positiven Bande bei 195 nm und negativen Banden bei 208 und 222 nm auf (Abb. 3a). Diese sind jedoch nicht so ausgeprägt wie die für Temporin L beobachteten, ein AMP mit einer starken Präferenz für die α-Helix-Konformation, und diese Unterschiede werden verstärkt, wenn die gleichen Experimente in Lipiddoppelschichten durchgeführt werden, die jeweils Gram-positiv modellieren (Abb. 3b) oder Gramnegative (Abb. 3c) Plasmamembranen. Die Verringerung der Intensität dieser Merkmale steht im Einklang sowohl mit einer zunehmenden Störung der α-Helix-Konformation als auch mit einer gewissen Übernahme der PII-Konformation, wobei die positive Bande bei 220 nm und die negative Bande bei 197 nm für PII erwartet werden und den spektralen Merkmalen der α-Helix entgegenstehen . Auch hier ist der Vergleich mit den CD-Spektren, die für Temporin L unter den gleichen Bedingungen erhalten wurden, deutlich (Abb. 3b, c).

Fern-UV-Zirkulardichroismus-Spektren von 50 µM Winterflunder-Peptiden oder Temporin L in 5 mM Tris-Puffer bei pH mit 5 mM SDS-Mizellen (a) oder 15 µM in Modellen von Gram-positiv (3 mM POPG-b) oder Gram-negativ (3 mM POPE:POPG (75:25) – c) bakterielle Plasmamembranen bei 37 °C. Die Spektren sind repräsentativ für drei unabhängig voneinander wiederholte Experimente. Ein Vergleich der HN- und HA-NOESY-Kreuzpeaklinienbreiten (Mittelwert und SD) für WF-AMPs und Temporin L (TL) in SDSd25 zeigt viel größere Linienbreiten für die WF-Peptide, was auf einen intermediären Austausch hinweist (d). Neu gelöste Strukturen der WF-AMPs sind wahrscheinlich Hybride von mindestens zwei Konformationen, die in SDS (f) übernommen wurden, und im Vergleich zu zuvor gelösten Strukturen von WF2 (2LS9) und insbesondere Temporin L (6GS5) werden geringere Anteile der α-Helix-Konformation identifiziert. (e). Die Segmente sind für die α-Helix violett, für die 3-10-Helix blau und für Windungen und Spulen cyan und weiß. Beachten Sie jedoch, dass „Define Secondary Structure of Proteins“ (DSSP) nicht in der Lage ist, die PII-Konformation zu identifizieren. Einfaktorielle ANOVA mit Bonferronis Mehrfachvergleichstest: *p < 0,05; **p < 0,01; ****p < 0,0001.

Drittens haben wir die Strukturen von WF1, WF1a, WF1a-1, WF3 und WF4 in SDS-Mizellen mithilfe der 2D-1H-1H-NOESY-NMR-Spektroskopie gelöst (Abb. 3f). Bemerkenswert ist, dass die Halbwertslinienbreiten für z. B. die HN-HA-Korrelationen viel größer als erwartet sind und dies im Vergleich zu denen, die für Temporin L erhalten wurden, deutlich größer ist (Abb. 3d). Solche großen Linienbreiten stehen im Einklang mit einem langsamen bis mittleren Austausch auf der NMR-Zeitskala. In diesen Szenarien überlappen sich die konformativ abhängigen chemischen Verschiebungen von zwei verschiedenen Konformerpopulationen und/oder Peptide wechseln im gleichen Zeitrahmen wie das NMR-Experiment von einer Konformation zur anderen, sodass beide Konformere untersucht werden. In Übereinstimmung damit sind ii + 4 NOEs nachweisbar, aber schwach und erstrecken sich nicht über die gesamte Peptidsequenz (ergänzende Abbildung 3) und daher, obwohl in den resultierenden Strukturmodellen ein Spulenmotiv erkennbar ist, viel weniger α-Helix oder 3–10 Helix wird beim Vergleich mit zuvor gelösten Strukturen von Temporin L oder sogar Pleurocidin erkannt (Abb. 3e).

Schließlich führten wir dreifache 200-ns-Simulationen der atomistischen Molekulardynamik (MD) von vier WF-AMP-Bindungen und -Insertionen in Doppelschichten durch, die entweder 512 POPG oder 384 POPE und 128 POPG-Lipide umfassten, um grampositive bzw. gramnegative Plasmamembranen zu modellieren. Anschließend bewerteten wir die intramolekulare H-Brücke und ermittelten in den letzten 20 ns jeder Simulation die durchschnittlichen Ramachandran-Winkel für jedes Peptid (ergänzende Abbildung 4). In Übereinstimmung mit den NMR-Strukturstudien werden relativ wenige intramolekulare ii + 4 (oder ii + 3) Wasserstoffbrückenbindungen nachgewiesen (ergänzende Abbildung 4). Obwohl WF1 und WF2 von den WF-AMPs eine höhere Anzahl von ii + 4 Wasserstoffbrückenbindungen aufweisen, wird dies in POPE/POPG durch das entsprechende Maß für das stark α-helicale Temporin L in den Schatten gestellt (ergänzende Abbildung 4B). Eine geringere intramolekulare Wasserstoffbindung durch WF-AMPs im Vergleich zu Temporin L wird nicht durch eine erhöhte Peptid-Lipid-Wasserstoffbindung ausgeglichen, selbst wenn ein solcher Effekt beobachtet wird, wenn Lysinreste in WF2 durch Arginin ersetzt werden, um Pleurocidin-KR zu erzeugen (ergänzende Abbildung 4C). Ramachandran-Diagramme für WF1a und WF2 (ergänzende Abbildung 4D, E) veranschaulichen die für die anderen WFs beobachteten Diagramme, in denen einzelne Peptide Regionen besetzen, die mit der α-Helix (φ –60 °; ψ –45 °) und PII (φ –75 °; ψ +150°) Konformationen. Wie bereits für Pleurocidin 30 festgestellt, ist die Konformationsflexibilität der WF-AMPs, bestimmt durch die zirkuläre Varianz von φ und ψ, relativ hoch, insbesondere im Vergleich zu z. B. Temporin L (ergänzende Abbildung 5A, B). Obwohl die Konformationsflexibilität von φ für WF1a in Kombination mit WF2 oder Pleurocidin-KR (ergänzende Abbildung 5C, D) verringert ist, wie am Beispiel von WF1a und WF2 (ergänzende Abbildung 4F), werden dennoch unterschiedliche einzelne WF-Peptide beobachtet nehmen beide Konformationen in synergistischen Kombinationen an.

Bei der weiteren Analyse der MD-Simulationen haben wir überlegt, ob es Unterschiede in der Penetration der WF-AMPs gibt, die ihre unterschiedlichen Wirksamkeiten erklären könnten (Abb. 4). Bemerkenswert ist, dass alle sechs WF-AMPs und Pleurocidin-KR im Vergleich zur POPE/POPG-Doppelschicht leichter in die POPG-Doppelschicht eindringen, ein Effekt, der für Temporin L nicht beobachtet wird (Abb. 4c). In POPG erreicht WF2 das Niveau der Lipidphosphate (Abb. 4a) und eine ähnliche Penetration wird durch Pleurocidin-KR, aber auch WF3 und WF4 erreicht, wobei die Penetration durch WF1, WF1a und WF1a-1 deutlich geringer ist (Abb. 4c). In POPE/POPG-Doppelschichten erreicht WF2 die Grenzflächenregion direkt über den Lipidphosphaten (Abb. 4b), und dies ist für alle Peptide mit Ausnahme von WF1 ähnlich.

Seitenansicht-Schnappschüsse für WF2/Pleurocidin nach 200 ns in POPG- (a) oder POPE/POPG-Doppelschichten (b) – der Übersichtlichkeit halber sind für die Lipide nur die Phosphoratome dargestellt. Der Massenschwerpunkt (COM) wird als Durchschnitt der vier Peptide in jeder Simulation über die letzten 100 ns in jeweils drei (WF und Pleu-KR) oder zwei (Temporin L) replizierten 200-ns-Simulationen angezeigt (c). Für Replikate werden Mittelwert und SE angezeigt. Zweifaktorielle ANOVA mit Šídáks Mehrfachvergleichstest: *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001.

Tatsächlich dringt WF1 von den drei WF-AMPs, denen es bei alleiniger Verwendung an antibakterieller Wirksamkeit mangelt, deutlich weniger in eine der beiden Doppelschichten ein als alle anderen Peptide, aber WF3 dringt leicht ein und WF1a dringt genauso stark ein wie sein viel wirksameres Analogon, WF1a-1, auch wenn weniger als WF2 in POPG (Abb. 4c).

Um den Einfluss der Peptidpenetration auf die Doppelschichten zu beurteilen, berechneten wir Parameter für die Reihenfolge der Lipidacylketten für Lipide innerhalb von 4 Å von jedem inserierenden Peptid. Bei POPG-Doppelschichten induzieren alle WF-AMPs eine erhöhte Unordnung (ergänzende Abbildung 6A). In den gemischten POPE/POPG-Doppelschichten ist die Störung der anionischen PG-Komponente aufgrund von WF-AMPs im hydrophoben Kern (zwischen Kohlenstoff 6 und 14) ähnlich, aber WF2 (Pleurocidin) stört die Acylketten stärker als die anderen WF-AMPs in der näheren Region zur Kopfgruppe (ergänzende Abbildung 6B). Der Störungseffekt ist im Allgemeinen für die PE-Komponente größer und für alle WF-AMPs ähnlich, mit Ausnahme von WF3, das eine stärkere Störung im hydrophoben Kern hervorruft (ergänzende Abbildung 6C).

In früheren Simulationen von acht Temporin-L-Peptiden, die an dieselben Doppelschichten binden, wie sie in der vorliegenden Studie verwendet wurden, beobachteten wir langanhaltende Zusammenlagerungen von drei, vier oder fünf Peptiden7. Hier ist die Bildung von Aggregaten bei halb so vielen Peptiden in jeder Simulation weniger wahrscheinlich, obwohl von allen WF-AMPs außer WF3 mindestens ein Dimer für mindestens 50 ns gebildet wird (ergänzende Abbildungen 7 und 8). Assemblierungen sind für Pleurocidin-KR im Vergleich zu WF2 weniger wahrscheinlich, für WF4 und WF1a jedoch wahrscheinlicher, wobei sich in einer WF1a-Simulation ein langlebiges Trimer bildet (ergänzende Abbildung 7). Obwohl WF3 im ungemischten Zustand eine Aggregation vermeidet, bildet sich in Kombination ein Trimer und bleibt in einer Simulation bestehen, was darauf hinweist, dass Heterooligomere möglich sind (ergänzende Abbildung 8A). WF-AMPs können sich daher zu Dimeren zusammenlagern, aber Anordnungen höherer Ordnung sind bei der aktuellen Peptidoberflächendichte selten.

Um festzustellen, ob sich eine der oben beschriebenen Eigenschaften ändert, wenn WF-AMPs in synergistischen Kombinationen vorhanden sind, wurden analoge MD-Simulationen durchgeführt, bei denen jeweils zwei WF-AMPs in den folgenden Kombinationen gemischt wurden: WF1a/WF2 in POPE/POPG-Doppelschichten (Abb. 5). ); WF1a/WF2 und WF1a/Pleurocidin-KR in POPG-Doppelschichten und WF1a/Pleurocidin-KR, WF2/WF3 und WF3/WF4 in POPE/POPG-Doppelschichten (Ergänzende Abbildungen 9–13).

Schwerpunktanalyse, bei der jeder Punkt ein Peptid in einer von drei Wiederholungssimulationen ist, der Balken der Mittelwert und der Fehler SE (a) ist. Seitenansicht-Schnappschuss für WF1a/Pleurocidin nach 200 ns (c). Parameter der Lipid-Acylketten-Reihenfolge für Lipide innerhalb von 4 Å um ein Peptid, dargestellt als Durchschnittswerte der drei Replikate für POPE (b) oder POPG (d) in gemischten POPE/POPG-Doppelschichten. Die Verteilung der Wasserstoffbrückenbindungen für WF1a (e, f) oder WF2 (g, h) verläuft unvermischt (e, g) oder als Kombinationen (f, h). Jedes Panel ist eine Summe aus vier Peptiden, wenn die Peptide ungemischt sind, bzw. jeweils zwei Peptiden bei den Kombinationen und ist repräsentativ für n = 3 Replikate. Zweifaktorielle ANOVA mit Šídáks Mehrfachvergleichstest: **p < 0,01.

Dadurch bleibt die Gesamtzahl der WF-AMPs, die jede Doppelschicht herausfordern (vier), erhalten, verringert jedoch die Anzahl jedes WF-AMP-Typs in jeder Simulation. Während die Penetration von WF-AMPs, wenn sie ungemischt sind, zwischen Replikatsimulationen sehr konsistent ist (Abb. 4c), wird die Penetration bei Kombination zwischen Replikaten und zwischen Peptiden in jeder Simulation variabler. Während einige WF2-AMPs die POPE/POPG-Doppelschicht im gleichen Ausmaß durchdringen wie im ungemischten Zustand, dringen einige Peptide in Gegenwart von WF1a viel weiter in die Doppelschicht ein (Abb. 5a), wobei ein Teil des Peptids zum ersten Mal über die Ebene hinaus eindringt der Phosphate (Abb. 5b). Der gleiche Effekt wird für die Kombination von WF1a und Pleurocidin-KR in POPG-Doppelschichten beobachtet (ergänzende Abbildung 9A), wobei ein ähnliches Verhalten für WF2 mit WF1a in POPG (ergänzende Abbildung 9A) und Pleurocidin-KR und WF1a in POPE/POPG beobachtet wird ( Ergänzende Abbildung 10B), auch wenn es keinen signifikanten Anstieg der durchschnittlichen Durchdringung gibt. Das Eindringen von POPE/POPG durch WF2 wird durch die Anwesenheit von WF3 nicht in gleicher Weise beeinflusst (ergänzende Abbildung 12A), aber WF4 dringt in Kombination mit WF3 weiter ein (ergänzende Abbildung 13A) und reicht bis unter die Lipidphosphatebene (ergänzende Abbildung). . 13C).

Bei den Kombinationen von WF1a/WF2 und WF2/WF3 wird die Störung von POPG, aber nicht von POPE-Lipiden abgeschwächt (Abb. 5b, d und ergänzende Abb. 12B, D), mit einem ähnlichen, aber weniger ausgeprägten Effekt für WF1a/Pleurocidin-KR ( Ergänzende Abb. 11B, D). Die durch die WF3/WF4-Kombination induzierte Störung ähnelt im Großen und Ganzen derjenigen, die durch die ungemischten Peptide erreicht wird (ergänzende Abbildungen 13B, D), ebenso wie die, die mit den WF1a/WF2- und WF1a/Pleurocidin-KR-Kombinationen in POPG erreicht wird (ergänzende Abbildungen 9B). und 11A).

Um einen Einblick in den Mechanismus zu erhalten, der diesen Verhaltensänderungen zugrunde liegt, haben wir untersucht, wie die WF-AMPs mit den Doppelschichten interagieren, indem wir die Peptid-Lipid-Wasserstoffbindung nach Rest im Zeitverlauf quantifiziert haben (Abb. 5e – h und ergänzende Abb. 9, 10, 12 und). 13). Während sich die Gesamtzahl der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem Peptid und den Lipiden zwischen den ungemischten Bedingungen und den Kombinationsbedingungen nicht ändert, ändert sich das für WF2 beim Einfügen in POPE/POPG-Doppelschichten in der Kombination beobachtete Muster erheblich, während das für WF1a davon unberührt bleibt (Abb. 5e). -H). Bemerkenswert ist, dass starke Wechselwirkungen zwischen Lipiden und insbesondere His11 und Lys14 sowie Lys8 und His15, die für die WF2-Insertion im ungemischten Zustand charakteristisch sind (Abb. 5g), fehlen oder in Kombination mit WF1a vermindert sind (Abb. 5h). Im Gegensatz dazu ist die Wasserstoffbindung am C-Terminus (Thr22, His23, Tyr24) verstärkt (Abb. 5g, h).

Der gleiche Effekt wird für die Insertion von WF2 in POPG-Doppelschichten in Gegenwart/Abwesenheit von WF1a beobachtet (ergänzende Abbildung 9C–F) und für die Insertion von analogem Pleurocidin-KR in eine der beiden Doppelschichten, wiederum in Gegenwart von WF1a (ergänzende Abbildung 10C– J). Bei Pleurocidin-KR ist der Effekt aufgrund des stärkeren Wasserstoffbrückenbindungspotentials seiner vier Arginine gegenüber den ursprünglichen Lysinen in WF2/Pleurocidin dramatischer. Das Vorhandensein von WF1a verändert daher das Peptid-Lipid-Wasserstoffbindungsmuster jedes Peptids, das auf der Pleurocidin-Matrize basiert. Interessanterweise wird das Wasserstoffbindungsmuster von WF2 auch durch die Anwesenheit von WF3 beeinflusst (ergänzende Abbildung 12E – H), und der gleiche Effekt wird für WF4 beobachtet, mit dem WF2 eine wesentliche Sequenzidentität und -ähnlichkeit aufweist (ergänzende Abbildung 13E – H).

In beiden Fällen wird das für WF3 beobachtete Wasserstoffbrückenbindungsmuster durch die Anwesenheit von WF2 oder WF4 nicht beeinflusst, aber für beide dieser Peptide führt die Anwesenheit von WF3 zu einer erheblichen Verstärkung der Wasserstoffbrückenbindung, die durch Gly13/Lys14 (WF2) oder Ala13/ vermittelt wird. Lys14 (WF4) auf Kosten anderer Wechselwirkungen, die dominieren, wenn die Peptide nicht gemischt sind. Daher zeigen die MD-Simulationen, dass weniger aktive WF-AMPs den Mechanismus modulieren können, durch den aktivere WF-AMPs mit Lipiddoppelschichten interagieren, es gibt jedoch bisher keine Beweise für das Gegenteil.

Schließlich untersuchten wir, ob das durch die MD-Simulationen gewonnene Verständnis der WF-AMP-Membranwechselwirkung auf atomarer Ebene mit Effekten in Zusammenhang stehen könnte, die möglicherweise eher mit der bakteriziden Aktivität in Zusammenhang stehen, und inwieweit die Membranaktivität die antimikrobielle Wirksamkeit und Synergie erklären kann. Ungeachtet der Fähigkeit von Pleurocidin, in Bakterien einzudringen und intrazelluläre Ziele zu erreichen11,12, verfügt es über wohlbekannte membranzerstörende Eigenschaften9,32 und sowohl Membranschäden als auch Penetrationsverhalten können durch geeignete Ionenleitfähigkeitsmessungen aufgedeckt werden.

Bei den Patch-Clamp-Experimenten bestand unser Ansatz darin, das Peptid zu titrieren, um die niedrigste Schwellenkonzentration zu finden, die die Ionenleitfähigkeit auslösen kann, und dann diese Membranaktivität sowohl qualitativ als auch quantitativ zu charakterisieren7,14,20,21. Interessanterweise korreliert diese Schwellenkonzentration, die für WF-AMPs ermittelt wurde, die Diphytanoyllipide in Frage stellen, mit der durchschnittlichen Störung der entsprechenden Palmitoyloleoyllipide in den MD-Simulationen (Abb. 6a). Möglicherweise besteht ein ähnlicher, aber schwächerer Zusammenhang zwischen der Penetration (COM) und der Schwellenkonzentration (Spearman r = 0,5593, p = 0,0634), es besteht jedoch kein Zusammenhang zwischen der Schwellenkonzentration und den durchschnittlichen MHKs für grampositive oder gramnegative Isolate (Abb. 6b). Obwohl die Ionenleitfähigkeitsmessungen empfindlich auf Schwankungen in der Fähigkeit des WF reagieren, Lipide in Modelldoppelschichten zu durchdringen und zu stören, erklären solche Unterschiede daher nicht die unterschiedlichen antibakteriellen Wirksamkeiten.

Die durch WF-AMPs in MD-Simulationen induzierte Störung der Lipidacylketten hängt mit der niedrigsten Konzentration zusammen, bei der die Ionenleitfähigkeit durch Patch-Clamp erkannt wird (a Pearson r = 0,7007, p = 0,0111). Bei diesen Konzentrationen lösen nur einige WF-AMPs eine erhebliche Membranaktivität aus (f DPhPG; g DPhPE/DPhPG) und die durchschnittlichen MHKs für grampositive oder gramnegative Bakterien stehen in keinem Zusammenhang mit diesen Schwellenkonzentrationen (b Pearson r = 0,4802; p = 0,1141; roter Strich = Identitätslinie). Bei seiner Schwellenkonzentration (7,5 µM) induziert WF2, d, g eine erhebliche Ionenleitfähigkeit in DPhPE/DPhPG-Doppelschichten, diese ist jedoch langsam (d, h) und geht der Zerstörung der Doppelschicht voraus. WF1a (15 µM) ist weitgehend inert (c, g). Durch die Kombination von WF2 (3,75 µM) und WF1a (5 µM) wird sichergestellt, dass eine erhebliche Ionenleitfähigkeit schneller und mit weniger Peptid (e, g, h) induziert wird. Die Zeit bis zum Einsetzen der Leitfähigkeit (h) ist der Durchschnitt und die SE von fünf unabhängigen Replikaten. Einfaktorielle ANOVA mit Bonferronis Mehrfachvergleichstest: ***p < 0,001.

Ein besseres Verständnis erhält man, wenn man die Art der bei den Schwellenkonzentrationen beobachteten Aktivität berücksichtigt, da erhebliche Unterschiede in der Art der Aktivität, der Häufigkeit von Leitfähigkeitsereignissen, der Größe der Leitfähigkeit und auch der Geschwindigkeit, mit der die Aktivität nach der Belastung beginnt, bestehen zum angewendeten WF AMP (Abb. 6c – h und ergänzende Abb. 14). Bei der Herausforderung von DPhPG-Doppelschichten hat die Modellierung der Plasmamembranen grampositiver Bakterien, WF1, WF1a und WF4, nur geringe Auswirkungen (Abb. 6f), während der Aktivitätsbeginn für WF3 sehr langsam ist (ergänzende Abb. 14A). Die DPhPE/DPhPG-Doppelschichten sind im Allgemeinen resistenter gegen die durch WF AMP induzierte Leitfähigkeit, wobei nur WF1a-1, WF4 und WF2 viele Leitfähigkeitsereignisse mit hoher Amplitude induzieren (Abb. 6g), während die durch WF2 induzierte Aktivität nur langsam einsetzt (Abb. 6d und). Ergänzende Abbildung 14B). Da nur diese Peptide eine starke Aktivität gegen gramnegative Bakterien aufweisen, stimmen diese Beobachtungen mit der relativen antibakteriellen Wirksamkeit der oben beschriebenen WF-AMPs überein.

Anschließend konzentrierten wir uns darauf, ob der Synergismus zwischen WF1a und WF2 überhaupt durch Änderungen der Ionenleitfähigkeit erklärt werden kann. WF1a hat bei seiner Schwellenkonzentration nur sehr geringe Auswirkungen (Abb. 6c, g), aber in Kombination mit WF2 ist die Ionenleitfähigkeit selbst bei niedrigeren Konzentrationen erheblich (Abb. 6e), mit vielen weiteren Leitfähigkeitsereignissen mit hoher Amplitude (Abb. 6g). und die Aktivität beginnt durchweg viel schneller (Abb. 6h). Letzteres ist eine aufkommende Eigenschaft, da WF1a allein zwar nicht wesentlich schneller ist als bei alleiniger Verwendung von WF1a (p = 0,0658), jedoch keine damit verbundene Leitfähigkeit induziert mit bakterizider Wirkung.

In der vorliegenden Studie zeigen wir, dass die Synergie zwischen den in der Winterflunder gefundenen AMPs die Wirksamkeit erhöht, die Kooperativität in der Pharmakodynamik der bakteriziden Aktivität erhöht und die therapeutischen Ergebnisse in einem Modell einer A. baumannii-Wundinfektion verbessert. Darüber hinaus präsentieren wir eine erste Untersuchung einiger Mechanismen, die der Synergie zugrunde liegen könnten, und geben Aufschluss darüber, wie weniger aktive WF-AMPs – WF1a oder WF3 – die Membraninteraktion aktiverer WF-AMPs – WF2/Pleurocidin oder WF4 – modulieren können. Während eine erfolgreiche Therapie infizierter Brandwunden in einem Wirbellosen-Infektionsmodell die Aussicht auf eine Übertragung dieser Ergebnisse auf Säugetiermodelle und letztendlich auf die Klinik eröffnet, bleiben noch grundlegendere Fragen offen. Dazu gehört, ob WF-AMPs an entstehenden Synergien in Kombinationen höherer Ordnung teilnehmen können und inwieweit Variationen in der Umgebung, der Bakterienart und dem Stamm die Kooperativität bei der bakteriziden Aktivität beeinflussen könnten und ob dies tatsächlich das Risiko und/oder die Häufigkeit von Resistenzen beeinflusst.

Die Identifizierung zahlreicher bidirektionaler synergistischer Kombinationen von WF-AMPs kann mit dem eleganten und effizienten Ansatz von Tekin et al. erreicht werden. und eine einfache Bouillon-Mikroverdünnung von WF-AMPs, gepaart entsprechend ihren individuellen MHK-Werten. Im Gegensatz zu Tekin et al. sind wir nicht in der Lage, aufkommende synergistische Kombinationen höherer Ordnung zu identifizieren, aber dies könnte die schnell bakterizide und hohe Kooperativität der AMP-Aktivität widerspiegeln. Der Ansatz basiert auf der Identifizierung von Antibiotikadosen, die zu kleinen, aber messbaren Wachstumseinbußen führen, so dass selbst bei Kombinationen höherer Ordnung entstehende Synergien identifiziert werden können, vorausgesetzt, Kombinationen niedrigerer Ordnung erzeugen keine vollständige Hemmung19. Aufgrund der hohen Kooperativität von AMPs ist es jedoch möglich, dass eine drastische Änderung der bakteriziden Aktivität mit nur einer geringen Änderung der AMP-Konzentration erreicht wird. Tatsächlich ist es möglich, dass bei einzelnen WF-AMPs keine Hemmung beobachtet wird und dass bei nur Zwei-Wege-Kombinationen eine nahezu vollständige Hemmung gefunden wird, und wir zeigen hier, dass die Kooperativität sogar bei Zwei-Wege-Kombinationen verstärkt wird. Daher werden wir wahrscheinlich einen anderen Ansatz benötigen, um Synergien höherer Ordnung zwischen AMPs zu identifizieren. Die ideale Methode ist sowohl ein hoher Durchsatz als auch die Fähigkeit, dosisabhängige und zeitaufgelöste Daten bereitzustellen, um auftretende Änderungen der bakteriziden Abtötungsrate zu berücksichtigen.

In der Zwischenzeit deuten MD-Simulationen jedoch auf Dreierkombinationen hin, die weiter untersucht werden sollten. Bemerkenswert ist, dass die MD-Simulationen zeigen, dass die Peptid-Lipid-Wasserstoffbindungsmuster von WF2/Pleurocidin und WF4 in ähnlicher Weise durch die Anwesenheit von WF3 beeinflusst werden, und daher stellt sich die Frage, ob WF3 beide Peptide gleichzeitig beeinflussen kann und welche Folgen dies haben wird diese beiden Effekte parallel. Im Gegensatz dazu unterscheiden sich die Auswirkungen von WF1a und WF3 auf das Peptid-Lipid-Wasserstoffbrückenbindungsmuster von WF2/Pleurocidin erheblich. Daher stellt sich die Frage, ob diese Effekte konkurrieren könnten oder ob ein anderes Verhalten auftritt. Bemerkenswert ist, dass sowohl WF2 als auch WF3 in den Kiemen der Winterflunder exprimiert werden (zusammen mit WF1)33 und WF2, WF3 und WF1a im Darm exprimiert werden, was die Frage aufwirft, wie die Umgebung und/oder Unterschiede in der bakteriellen Bedrohung diese beeinflussen Funktion verschiedener synergistischer Kombinationen. Die Expression von WF4 wurde in der Haut oder im Darm von Erwachsenen nicht gefunden, andere Gewebe und Lebensstadien wurden jedoch nicht beprobt und es gab keinen Krankheitserregerbefall, der die Expression auslösen könnte33. Die physiologische Rolle von WF4 und die Kombinationen, an denen es beteiligt sein könnte, bleiben daher vorerst unklar. Dennoch ist es wahrscheinlich, dass die Koexpression von WF2 mit WF1a und/oder WF3 in situ dem angeborenen Immunsystem der Winterflunder Vorteile hinsichtlich der antibakteriellen Wirksamkeit bringen kann, was zu einer höheren Selektivität und geringeren Kollateralschäden an der Infektionsstelle führen kann. Darüber hinaus muss die durch die Kombination verschiedener WF-AMPs erzielte Steigerung der Kooperativität der bakteriziden Wirkung laut der von Rolff und anderen vertretenen Theorie1,2,34 die Entwicklung einer Resistenz gegen das angeborene Immunsystem der Winterflunder begrenzen, obwohl dies noch getestet werden muss Antwort.

In der vorliegenden Studie konnten wir nachweisen, dass schwach aktive WF-AMPs wie WF3 oder WF1a in der Lage sind, die Membraninteraktion aktiverer WF-AMPs wie WF4 oder WF2/Pleurocidin zu modulieren. Wir zeigen weiterhin, dass nur diejenigen WF-AMPs, die bei ihren Schwellenkonzentrationen eine erhebliche Membranaktivität induzieren, eine starke antibakterielle Aktivität aufweisen und dass diese Aktivität bei niedrigeren Dosen von WF2/Pleurocidin durch WF1a verstärkt und beschleunigt wird. Dieser Effekt erklärt wahrscheinlich den in dieser Kombination beobachteten synergistischen Wirkungsgewinn, und dennoch liegen die gramnegativen MHK-Werte sowohl für WF2 als auch für WF1a-1 deutlich unter der Schwellenkonzentration in Patch-Clamp. Dies würde darauf hindeuten, dass hinter dem bakteriziden Mechanismus mehr steckt als nur die Membranzerstörung für beide Peptide und dass die Membranzerstörung für einige Bakterienarten eine weniger wirksame bakterizide Strategie darstellt. Da die Fähigkeit von WF2/Pleurocidin, in Bakterien einzudringen und intrazelluläre Ziele zu zerstören, für WF2/Pleurocidin11,12,13 gut belegt ist und für WF1a-1 keine ähnliche Studie existiert, besteht daher die Notwendigkeit, nicht membranbezogene Beiträge dazu zu untersuchen Potenz und Synergie genauer untersuchen, um die Wirkung vollständig zu verstehen.

Während WF-AMP-Effekte über die bakterielle Plasmamembran hinaus auch die Kooperativität der bakteriziden Wirkung beeinflussen können – tatsächlich steht die hier beobachtete hohe Kooperativität von Gentamicin im Einklang mit der hohen Kooperativität seiner Bindung an zwei von drei Klassen von Bindungsstellen am 70 S-Ribosom35 –, ist die Fähigkeit MD-Simulationen zur Identifizierung der Modulation der WF4- und WF2/Pleurocidin-Bindung und -Insertion in Modellen der Plasmamembran durch WF1a und/oder WF3 legen nahe, dass diese Technik zumindest einen Teil der Veränderung der bakteriziden Pharmakodynamik in Zwei-Wege-Kombinationen aufdecken könnte. Eine verstärkte Kooperativität bei der bakteriziden Aktivität in zweifach synergistischen Kombinationen erfordert eine relative Hemmung der Aktivität bei niedrigen AMP-Konzentrationen und eine Verstärkung der Aktivität bei höheren Konzentrationen. Merkmale, die jeden dieser Effekte unterstützen könnten, werden bei der hier getesteten Einzelkonzentration beobachtet, insbesondere die Störung des Peptid-Lipid-Wasserstoffbindungsmusters, die für WF2/Pleurocidin und WF4 im ungemischten Zustand beobachtet wird, aber auch die erhöhte Penetration von WF2 (mit WF1a) und WF4 (mit WF3). Dosisabhängige Veränderungen dieses Verhaltens können daher ein mechanistisches Verständnis der Bedeutung dieser Effekte liefern und können mit dosisabhängigen, zeitaufgelösten Studien der Plasmamembrandepolarisation und intrazellulären Zielstörung kombiniert werden, um ein umfassendes Verständnis der Kooperativität und Geschwindigkeit der bakteriziden Wirkung zu gewinnen.

Wir zeigen hier auch, dass die Fähigkeit, sowohl α-Helix- als auch Polyprolin-II-Konformationen in Membranumgebungen anzunehmen, ein besonderes Merkmal von WF-AMPs ist. Ihre Bedeutung ist jedoch noch nicht verstanden, da die WF-AMPs zwar leichter in phosphatidylglycerolreiche Doppelschichten eindringen können als andere AMPs, die nur α-Helix-Konformationen annehmen, wir jedoch noch keinen besonderen Vorteil der PII-Konformation oder der Fähigkeit, zwischen ihnen zu wechseln, feststellen konnten die beiden Konformationen oder jede Änderung dieses Verhaltens in WF-AMP-Kombinationen (über eine geringfügige Verringerung der Flexibilität für WF1a hinaus).

Beim Vergleich der Kooperativität der bakteriziden Aktivität von WF AMP zwischen Bakterienarten und zwischen verschiedenen Stämmen von A. baumannii können wir zeigen, dass die antibakterielle Pharmakodynamik von AMPs stark von der Art des bakteriellen Ziels beeinflusst wird. Die Pharmakodynamik der bakteriziden Wirkung kann sich nach der Anpassung an Antibiotika sowohl verbessern als auch verschlechtern36, und der Ursprung der hier beobachteten geringeren Kooperativität für WF-AMPs gegenüber dem antibiotikaresistenteren AYE-Stamm im Vergleich zu A. baumannii ACTCC 19778 erfordert weitere Untersuchungen.

Zusammenfassend stellen wir fest, dass Synergien die Wirksamkeit und bakterizide Pharmakodynamik von AMPs aus demselben Organismus und in demselben Gewebe verbessern können, was die Therapie verbessert. Das PD-Profil kann jedoch je nach Art und/oder Stamm variieren, und es besteht die Notwendigkeit, Beiträge sowohl von Bakterien und ihrer Umgebung als auch von den AMPs selbst zu identifizieren, um zu verstehen, wie PD manipuliert wird. Mit einem solchen Verständnis kann eine Untersuchung erfolgen, ob und wie ein variierendes PD-Profil tatsächlich mit einem Resistenzrisiko zusammenhängt, und die Vorteile werden voll und ganz gewürdigt.

Alle Peptide wurden von Cambridge Research Biochemicals (Cleveland, UK) in entsalzter Qualität (roh) gekauft. Die Rohpeptide wurden unter Verwendung von Wasser/Acetonitril-Gradienten unter Verwendung einer Waters SymmetryPrep C8, 7 µm, 19 × 300 mm-Säule weiter gereinigt. Alle Peptide waren am C-Terminus amidiert. Die Lipide 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) (POPG), 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (POPE), 1 ,2-Diphytanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DPhPG) und 1,2-Diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DPhPE) wurden von Avanti Polar Lipids, Inc. gekauft. (Alabaster, AL) und ohne jegliche Reinigung verwendet. Alle anderen Reagenzien wurden in analytischer Qualität oder besser verwendet. Bakterienisolate stammen aus einer Sammlung, die von UKHSA14 verwaltet wird.

Die antibakterielle Aktivität der Peptide wurde durch einen modifizierten zweifachen Bouillon-Mikroverdünnungstest mit modalen MHKs bewertet, die aus mindestens drei biologischen Replika-Experimenten generiert wurden37. Die Methode folgte im Großen und Ganzen der EUCAST-Methodik, wobei der nicht kationenbereinigte Mueller Hinton den kationenbereinigten Mueller Hinton ersetzte. Peptide und Antibiotika wurden in einer zweifachen Verdünnung in Medien auf einer 96-Well-Platte verdünnt. Anschließend wurden Bakterien, rückverdünnt aus einer Übernachtkultur, in einer Anfangskonzentration von 5 × 105 KBE/ml zugegeben. Die Platten wurden 20 Stunden lang statisch bei 37 °C inkubiert und die OD600 wurde mit einem Clariostar-Plattenlesegerät (BMG Labtech) bestimmt. Die MHK wurde als die niedrigste Konzentration definiert, bei der das Wachstum <0,1 über der Hintergrundabsorption lag.

Die Methode von Tekin et al. unter den gleichen Bedingungen befolgt wurde wie die MICs19. Kurz gesagt wurde ein antibakterieller Aktivitätstest wie oben in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und das Endpunktwachstum zur Berechnung der Peptidkonzentration verwendet, die 10 % des Wachstums hemmte. Peptide in diesen Konzentrationen wurden sowohl allein als auch in Kombinationen von 2, 3, 4, 5 oder allen 6 Peptiden zu einer Gesamtmenge von 100 µl in die Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen gegeben. Anschließend wurden 100 µl Bakterien in einer Ausgangskonzentration von 5 × 105 KBE/ml zugegeben und die Platte 20 Stunden lang statisch bei 37 °C inkubiert. Die OD600 wurde mit einem Clariostar-Plattenlesegerät (BMG Labtech) bestimmt. Für jede Kombination wurde die prozentuale Wachstumshemmung im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrolle berechnet. Die Nettounabhängigkeitssynergie von Bliss wurde nach Tekin et al. berechnet. durch Subtrahieren der additiven Hemmung der einzelnen Peptide von der Gesamthemmung der Kombination.

Paarweise Kombinationen von Peptiden wurden nach einer angepassten MIC-Methode wie folgt getestet. Kombinationen aus zwei Peptiden, wobei jede Verbindung ihre MHK-Konzentration hatte, wurden in die erste Reihe einer 96-Well-Platte gegeben und in einer zweifachen Reihenverdünnung auf der Platte verdünnt. Bakterien wurden wie in einem Standard-MIC-Assay hinzugefügt, die Platte wurde unter den gleichen Bedingungen inkubiert und der MIC der Kombination wurde auf die gleiche Weise definiert. Die fraktionierte Hemmkonzentration wurde aus der kombinierten MHK für zwei unabhängige Wiederholungen berechnet und als durchschnittlicher +/– Standardfehler des Mittelwerts dargestellt. FIC wird berechnet als (MIC von Verbindung A in Kombination mit B/MIC von Verbindung A allein) + (MIC von Verbindung B in Kombination mit A/MIC von Verbindung B allein). Wenn die MHK > 128 µg/ml betrug, wurde zur Berechnung des FIC eine angenommene MHK von 256 µg/ml verwendet und der Kombination eine Spitzenkonzentration von 128 µg/ml hinzugefügt. FIC-Werte ≤ 0,5 galten als stark synergistisch und im Einklang mit einer kürzlich durchgeführten Neubewertung von FIC, die die Bedeutung der Messung der MHK auch in derselben Microarray-Platte hervorhebt, waren Werte von 0,5–<1 schwach synergistisch18.

Die Synergie wurde mithilfe von Standard-Mikroverdünnungs-Chequerboard-Assays unter den gleichen Bedingungen wie die MICs mit RPMI140 + 5 % FBS, die zusammen mit MHB18 verwendet wurden, gemessen. Zweifache Verdünnungsreihen jedes Peptids oder Antibiotikums wurden in separaten 96-Well-Platten hergestellt und dann vor der Zugabe der Bakterien zu einer kombiniert. Die Wachstums-/kein-Wachstums-Grenzfläche wurde mit der gleichen Definition wie die MHK bestimmt. Die fraktionierte Hemmkonzentration wurde aus der synergistischsten Vertiefung auf der Platte für drei unabhängige Wiederholungen berechnet und wie oben dargestellt. Zur Erhöhung der Reproduzierbarkeit wurden die MHK-Werte auf denselben Platten wie die FIC-Werte bestimmt.

Pharmakodynamische In-vitro-Tests wurden mit epidemischem Methicillin-resistentem S. aureus 15 (EMRSA-15 NCTC 13616), kultiviert in RPMI140 + 5 % FBS oder in Mueller-Hinton-Bouillon, und A. baumannii ATCC 17978 oder AYE, kultiviert in Mueller-Hinton-Bouillon (MHB), durchgeführt ). Beim Testen von Daptomycin wurde kationenangepasstes MHB (CA-MHB) verwendet, da für die Aktivität Ca2+-Ionen erforderlich sind. Die Bakterien wurden über Nacht in 10 ml MHB oder RPMI + 5 % FBS bei 37 °C kultiviert und unmittelbar vor der Plattenimpfung auf eine OD600 von 0,002 verdünnt. Stammlösungen von WF1a, WF2, WF3, WF4, D-WF1a, D-WF2, Tobramycin, Gentamicin, Daptomycin, Imipenem, Meropenem oder Ciprofloxacin wurden in sterilem Milli-Q-Wasser mit einer Konzentration von 200× MIC hergestellt. Daptomycin wurde in Methanol in einer Konzentration von 2000× MIC hergestellt und in der ersten Vertiefung mit Medium auf 200× MIC verdünnt. In der oberen Reihe einer 96-Well-Platte aus Polypropylen wurde eine Verdünnungsreihe von 200 × oder 100 × MIC (siehe Ergänzungstabelle 5 für Spitzenkonzentrationen für jede Bedingung) bis 0,2 × MIC in einem Volumen von 100 μl durchgeführt, wozu 100 μl hinzugefügt wurden Der Bakteriensuspension wurden zugesetzt, um insgesamt 1 × 106 log-Phase-koloniebildende Einheiten (KBE) in 200 μl zu erhalten. Die erste t = 0-Probe wurde <30 s nach Zugabe der Bakterien zur Platte entnommen, weitere Proben wurden in geeigneten Abständen danach entnommen. Aufgrund der schnellen Abtötung wurden 120 Minuten lang alle 20 Minuten Proben von Peptid-belasteten Bakterien entnommen, während 6 Stunden lang jede Stunde Proben von Tobramycin-, Gentamicin-, Daptomycin-, Imipenem-, Meropenem- und Ciprofloxacin-belasteten Bakterien entnommen wurden. Aus jeder Vertiefung wurde ein Volumen von 15 μl entnommen und gemäß der Tropfplattenmethode zur Zählung von Bakterien38 1:1000 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt und auf MH-Agar- oder CA-MH-Agarplatten ausplattiert. Zur CFU-Zählung wurden die Platten über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die CFU-Daten wurden log10-transformiert und die bakterielle Nettowachstumsrate wurde aus der Zunahme oder Abnahme der CFU während der Zeit der Exposition gegenüber den Peptiden oder Antibiotika als Koeffizient einer linearen Regression von log10 CFU als Funktion der Zeit bestimmt. Der Schnittpunkt der Regression wurde festgelegt, indem die Regressionslinien durch die erste CFU-Messung (0 Minuten) bei einer bestimmten antimikrobiellen Konzentration gezwungen wurden. Die pharmakodynamische Funktion nach Regoes et al. beschreibt die Beziehung zwischen der bakteriellen Nettowachstumsrate ψ und der Konzentration eines antimikrobiellen Mittels (a)39:

Die Anpassung dieser Funktion an die Nettowachstumsraten der Bakterien in OriginPro 2020 (OriginLab Corporation, Northampton, MA) generiert die Parameter ψmin bzw. ψmax, die minimale und maximale Wachstumsrate, zMIC, die pharmakodynamische minimale Hemmkonzentration, und κ, ein Maß für die Kooperation. Durchschnittliche Parameter, die aus Anpassungen von drei oder mehr unabhängig voneinander wiederholten Experimenten erhalten wurden, wurden durch eine einfache ANOVA mit einem Tukey-Post-hoc-Test verglichen. Da die CFU-Daten log10-transformiert sind, werden die Nettowachstumsraten anschließend auf drei signifikante Zahlen übertragen.

Die antimikrobiellen Aktivitäten von WF-AMPs und den klinisch relevanten Antibiotika Gentamicin, Ciprofloxacin, Imipenem und Meropenem gegen eine Verbrennungswundeninfektion mit A. baumannii ATCC 17978 wurden an Galleria mellonella-Larven getestet. Vor der Verwendung wurde die Oberfläche von G. mellonella durch Eintauchen in 50 % Ethanol für 20 Sekunden dekontaminiert und trocknen gelassen. Alle Tests wurden bei drei verschiedenen Gelegenheiten mit einer Gruppengröße von 10 Larven durchgeführt; Die Larven wurden für die Dauer des Experiments in separaten Petrischalen und im Dunkeln in einem statischen Inkubator bei 37 °C gehalten. Unmittelbar vor dem Experiment wurden frische Agarplatten von A. baumannii ATCC 17978 hergestellt. Die Larven wurden mit dem flachen Kopf eines Nagels verbrannt, der in einer blauen Bunsenbrennerflamme rotglühend erhitzt, 15 Sekunden lang abgekühlt und 2 Sekunden lang oberflächlich angelegt wurde, um eine 2 mm2 große Verbrennung zu erzeugen. Die Larven wurden mit einer einzelnen Kolonie von A. baumannii ATCC 17978 infiziert, die direkt auf die Verbrennungsstelle aufgetragen wurde. Die Behandlung erfolgte topisch 1 Stunde nach der Infektion in einem Volumen von 5 µl oder steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung als Kontrolle. Das Überleben wurde über 96 Stunden überwacht.

Die NMR-Proben bestanden aus einer 0,5 mM Peptidlösung, die außerdem 50 mM deuteriertes Natriumdodecylsulfat (SDS-d25) mit 5 mM Tris(hydroxymethyl-d3)-amino-d2-methan-Puffer bei pH 7 enthielt. 10 % D2O enthielt Trimethylsilylpropansäure (TSP) wurde für das Lock-Signal und als interne chemische Verschiebungsreferenz hinzugefügt. Während der NMR-Experimente wurde die Temperatur konstant bei 298 K gehalten. NMR-Spektren wurden mit einem Bruker Avance 600 MHz (WF1a, ausschließlich bei 700 MHz) Spektrometer (Bruker, Coventry, UK) aufgenommen, das mit einer Kryosonde ausgestattet war. Es wurden Standard-Bruker-TOCSY- und NOESY-Pulssequenzen verwendet, wobei die Wasserunterdrückung mithilfe einer WATERGATE 3-9-19-Sequenz mit Gradienten (mlevgpph19 und noesygpph19) erfolgte. Der 1H-90-Grad-Impuls wurde bei 37,04 kHz kalibriert. Die TOCSY-Mischzeit betrug 80 ms und die Mischzeit für die NOESY-Spektren wurde auf 200 ms eingestellt. Die Entspannungsverzögerung betrug 1 s. In der direkten Dimension wurden 2048 Datenpunkte und in der indirekten Dimension 512 Datenpunkte erfasst. Die Spektren wurden mit Bruker TOPSPIN verarbeitet. Der freie Induktionszerfall wurde mit einer verschobenen Sinus2-Fensterfunktion multipliziert. Nach der Fourier-Transformation wurden die Spektren phasenkorrigiert, eine Basislinienkorrektur angewendet und die Spektren auf das TSP-Signal bei 0 ppm kalibriert.

Für Aufgabenstellungen und Strukturberechnungen wurde die Software Dynamo40 verwendet. Interprotonen-NOEs-Wechselwirkungen wurden als Abstandsbeschränkungen bei der Strukturberechnung mit dem Annealing-Protokoll in Dynamo verwendet. In diesem Fall wurden nur eindeutige NOEs verwendet, die anhand ihrer relativen Intensität in den NOESY-Spektren als stark, mittel und schwach klassifiziert wurden. Unter Verwendung dieser Klassifizierung wurden Obergrenzen von 0,27, 0,33 bzw. 0,50 nm angewendet, um den entsprechenden Abstand zwischen den Protonen einzuschränken. Eintausend Strukturen wurden berechnet und die 100 Konformere mit der niedrigsten potentiellen Energie ausgewählt, ausgerichtet und die quadratische mittlere Abweichung (RMSD) der schweren Atome im Rückgrat in Bezug auf ihre durchschnittliche Struktur berechnet. Lösungsmittelmoleküle wurden in die Berechnungen nicht einbezogen. Strukturkoordinaten wurden in der Proteindatenbank (www.rcsb.org) hinterlegt – siehe Erklärung „Datenverfügbarkeit“.

Die Simulationen wurden entweder auf der KCL Rosalind High Performance Computing (HPC)-Einrichtung oder auf Dell Precision Quad-Core-T3400- oder T3500-Workstations durchgeführt, die mit einem 1-kW-Netzteil (PSU) und zwei NVIDA PNY GeForce GTX570- oder GTX580-Grafikkarten und gelegentlich dem ARCHER ausgestattet waren Cray XC30-Supercomputer mit Gromacs 2018 oder 202041. Das CHARMM36-Allatom-Kraftfeld wurde in allen Simulationen verwendet42,43,44. Alle Membranen in diesem Projekt enthielten insgesamt 512 Lipide, bestehend entweder aus POPE/POPG (75:25 mol:mol) oder POPG. Vier Peptide wurden mindestens 30 Angström über der Lipiddoppelschicht in zufälliger Position und Ausrichtung mit einem Abstand von mindestens 20 Angström eingefügt. Die Ausgangsstrukturen wurden der NMR-Berechnung in SDS-Mizellen entnommen. Wie zuvor wurden Histidinreste protoniert14, Aspartat- oder Glutamatreste blieben jedoch in ihrer anionischen Form zurück. Das System wurde mit TIP3P-Wasser solvatisiert und zur Neutralisierung mit Na+-Ionen versetzt. Die Energieminimierung wurde bei 310 K mit dem Nose-Hoover-Thermostat unter Verwendung des Algorithmus für den steilsten Abfall durchgeführt, bis die maximale Kraft weniger als 1000,0 kJ/ml/nm (<4000 Schritte) betrug. Die Äquilibrierung wurde unter Verwendung des NVT-Ensembles für 100 ps und dann des NPT-Ensembles für 1000 ps mit Positionsbeschränkungen für die Peptide durchgeführt. Wasserstoffhaltige Bindungswinkel wurden mit dem LINCS-Algorithmus eingeschränkt. Abschließende Simulationen wurden im NPT-Ensemble mit 2-fs-Intervallen durchgeführt, wobei die Trajektorien alle 2 ps aufgezeichnet wurden. Alle Simulationen wurden dreifach über insgesamt 200 ns durchgeführt, wobei Peptide an unterschiedlichen Positionen und Orientierungen eingefügt wurden, was eine Gesamtsimulation von etwa 10,8 µs ergab. Torsionswinkel sind kreisförmige Größen und der kreisförmige Mittelwert der Psi- oder Phi-Winkel kann wie folgt berechnet werden:

Ebenso wird die zugehörige kreisförmige Varianz für Psi- oder Phi-Winkel wie folgt berechnet:

Var (ψ) = 1 − Amber

wobei R gegeben ist durch:

Fern-UV-CD-Spektren der an kleine unilamellare Vesikel (SUV) gebundenen Peptide wurden mit einem Chirascan Plus-Spektrometer (Applied Photophysics, Leatherhead, UK) erhalten, wobei die Proben bei 310 K gehalten wurden. Zur Herstellung von SUV wurden Lipidpulver in Chloroform gelöst und getrocknet unter Rotorverdampfung. Um das organische Lösungsmittel vollständig zu entfernen, wurden die Lipidfilme über Nacht unter Vakuum belassen und in 5 mM Tris-Puffer (pH 7,0) hydratisiert. Die Lipidsuspension wurde zur weiteren Probenhomogenisierung fünf schnellen Gefrier-Auftau-Zyklen unterzogen. POPE/POPG (75:25, mol:mol) und POPG-SUVs wurden durch Ultraschallbehandlung der Lipidsuspension auf Soniprep 150 (Measuring and Scientific Equipment, London, UK) für 3 × 5 Minuten mit einer Amplitude von 6 Mikrometern in Gegenwart von Eis erhalten um einen Lipidabbau zu vermeiden. Die SUVs wurden bei 4 °C gelagert und innerhalb von 5 Tagen nach der Herstellung verwendet. Fern-UV-CD-Spektren wurden von 260 bis 190 nm aufgezeichnet. Die SUV-Suspension wurde mit einer Endkonzentration von 3,0 mM in eine 0,5-mm-Küvette gegeben und dann wurden einige μl einer konzentrierten Peptidlösung hinzugefügt und gründlich gemischt, um eine Endkonzentration des Peptids von 15 μM zu ergeben. Die gleichen experimentellen Bedingungen wurden zur Untersuchung der Peptidsekundärstruktur in SDS-Mizellen verwendet, wobei die SDS-Mizellenkonzentration 5 mM mit 50 µM Peptid betrug. Bei der Verarbeitung wurde ein Spektrum der peptidfreien Lipidsuspension oder SDS-Lösung subtrahiert und eine Savitsky-Golay-Glättung mit einer Faltungsbreite von 5 Punkten angewendet.

Wie in unserer früheren Arbeit18 werden hier Lipide mit Diphytanoylketten verwendet, um riesige unilamellare Vesikel (GUV) zu bilden. GUVs bestehend aus DPhPE/DPhPG (60:40, Mol:Mol) und DPhPG wurden in Gegenwart von 1 M Sorbitol durch die Elektroformationsmethode in einer mit Indium-Zinnoxid (ITO) beschichteten Glaskammer hergestellt, die mit dem Nanion Vesicle Prep Pro-Aufbau verbunden war (Nanion Technologies GmbH, München, Deutschland) unter Verwendung einer Spitze-zu-Spitze-Wechselspannung von 3 V bei einer Frequenz von 5 Hz für 120 bzw. 140 Minuten bei 37 °C. Doppelschichten wurden durch Zugabe der GUV-Lösung zu einem Puffer, der 250 mM KCl, 50 mM MgCl2 und 10 mM Hepes (pH 7,00) enthielt, auf eine Öffnung in einem Borosilikatchip (Port-a-Patch®; Nanion Technologies) und Auftragen von 70–90 gebildet mbar Unterdruck führt zu einer lösungsmittelfreien Membran mit einem Widerstand im GΩ-Bereich. Nach der Bildung wurde eine kleine Menge Peptid-Stammlösung (in Wasser) zu 50 μl Pufferlösung gegeben, um die aktive Konzentration zu erhalten. Alle Experimente wurden mit einem positiven Haltepotential von 50 mV durchgeführt. Die aktive Konzentration, also die Konzentration, bei der das Peptid zum ersten Mal Membranaktivität zeigte, wurde für jedes Peptid durch eine unter den gleichen Bedingungen durchgeführte Titration ermittelt. Für alle Experimente wurden mindestens 6 konkordante Wiederholungen durchgeführt. Stromspuren wurden mit einer Abtastrate von 50 kHz mit einem EPC-10-Verstärker von HEKA Elektronik (Lambrecht, Deutschland) aufgezeichnet. Das System wurde computergesteuert durch die Software PatchControl™ (Nanion) und GePulse (Michael Pusch, Genua, Italien). Die Daten wurden mit dem eingebauten Bessel-Filter des EPC-10 bei einer Grenzfrequenz von 10 kHz gefiltert. Die Experimente wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Datenanalyse wurde mit dem Softwarepaket pClamp 10 (Axon Instruments) durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Zu den ergänzenden Informationen gehören eine ausführlichere Analyse der MD-Simulationsdaten, Zirkulardichroismus-Experimente und eine weitere Analyse der Patch-Clamp-Daten. Strukturkoordinaten wurden in der Proteindatenbank (www.rcsb.org) und der Biological Magnetic Resonance Bank (BMRB; www.bmrb.wisc.edu) unter den Zugangscodes 6S2D, 6RYQ, 6RY9, 6RZ1 und 6RZC (PDB) und 34416 hinterlegt , 34411, 34410, 34412 und 34413 (BMRB) für WF1, WF1a, WF1a-1, WF3 bzw. WF4. Zusätzlich zu den Strukturkoordinaten sind die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die in diesem Artikel beschriebenen NMR-Experimente wurden in den Einrichtungen des Centre for Biomolecular Spectroscopy des King's College London durchgeführt und von Dr. Andrew Atkinson unterstützt. Die King-Instrumente wurden mit einem Multi-User Equipment Grant des Wellcome Trust und einem Infrastructure Grant der British Heart Foundation erworben. Die Autoren würdigen die Nutzung der Forschungsrechenanlage am King's College London, Rosalind (https://rosalind.kcl.ac.uk), die in Zusammenarbeit mit den biomedizinischen Forschungszentren des National Institute for Health Research (NIHR) in Südlondon bereitgestellt wird & Maudsley und Guy's & St. Thomas' NHS Foundation Trusts und teilweise finanziert durch Investitionszuschüsse der Maudsley Charity (Auszeichnung 980) und Guy's & St. Thomas' Charity (TR130505). Die geäußerten Ansichten sind die der Autoren und nicht unbedingt die des NHS, des NIHR, des King's College London oder des Ministeriums für Gesundheit und Soziales. Für diese Arbeit wurde der ARCHER UK National Supercomputing Service (http://www.archer.ac.uk) verwendet. CDL würdigt das anregende Forschungsumfeld, das das EPSRC Center for Doctoral Training in Cross-Disciplinary Approaches to Non-Equilibrium Systems (CANES, EP/L015854/1) bietet. PMF wurde durch ein vom EPSRC finanziertes Health Schools Studentship (EP/M50788X/1) unterstützt. AJM erhielt Mittel aus einem NC3Rs Skills & Knowledge Transfer-Stipendium (NC/T001240/1). JR wird durch ein BBSRC LIDo iCASE-Stipendium (2547373) unterstützt. CH und M. Clifford wurden durch Mittel des PHE Pipeline-Fonds und zuletzt durch das PHE Grant in Aid-Projekt 109505 unterstützt.

Institut für Pharmazeutische Wissenschaft, School of Cancer & Pharmaceutical Science, King's College London, Franklin-Wilkins Building, 150 Stamford Street, London, SE1 9NH, Großbritannien

Maria Clarke, Philip M. Ferguson, Georgia Manzo, Bhumil Mistry, Bingkun Yue, Janis Romanopoulos, J. Mark Sutton und A. James Mason

Technology Development Group, UK Health Security Agency, Forschung und Evaluierung, Porton Down, Salisbury, SP4 0JG, Großbritannien

Charlotte K. Hind, Melanie Clifford und J. Mark Sutton

Zentrum für biomolekulare Spektroskopie und Randall-Abteilung für Zell- und Molekularbiophysik, King's College London, New Hunt's House, London, SE1 1UL, Großbritannien

Tam T. Bui und Alex F. Drake

Fachbereich Physik, King's College London, London, WC2R 2LS, Großbritannien

Christian D. Lorenz

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AJM verfasste den Haupttext des Manuskripts, bereitete alle Abbildungen vor und entwarf zusammen mit JMS und CDL die Recherche. M. Clarke führte strukturelle NMR-Studien, Patch-Clamp-Studien, CD-Experimente und Galleria mellonella-Experimente durch und führte zusammen mit PMF, CDL und BY atomistische Simulationsdaten durch und/oder analysierte sie. Mit Unterstützung von BM führte M. Clarke auch In-vitro-PD-Experimente durch. GM hat Patch-Clamp-Studien entwickelt. TTB und AFD unterstützten bei der Analyse und Interpretation von CD-Messungen. CKH, M. Clifford, M. Clarke, JR und JMS führten und/oder entwickelten in vitro antibakterielle Tests durch. Alle Autoren stimmten dem Manuskript zu.

Korrespondenz mit Christian D. Lorenz, J. Mark Sutton oder A. James Mason.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Clarke, M., Hind, CK, Ferguson, PM et al. Synergie zwischen den antimikrobiellen Peptiden der Winterflunder. npj Antimicrob Resist 1, 8 (2023). https://doi.org/10.1038/s44259-023-00010-7

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Eingegangen: 21. März 2023

Angenommen: 23. Juni 2023

Veröffentlicht: 10. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s44259-023-00010-7

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